05 | Attività antitrombotica di peptidi derivati dal latte: caratterizzazione di campioni di latte digerito e valorizzazione del prodotto (latte addizionato)

Abstract

Nel presente lavoro viene descritto un protocollo digestivo e purificativo volto ad ottenere frazioni dotate di attività antirombotica. Sono stati saggiati i vari digeriti comparandone l’attività con quella di peptidi standard ad attività antitrombotica nota. Le condizioni di digestione stono state le seguenti: Enzima (Chimotripsina) sciolto in Tris-HCl 50mM a pH 7.8.  Rapporto Proteine latte: Enzima = 20:1

Incubazione per 24 Ore a +4C°. La digestione enzimatica è stata bloccata tramite inattivazione al calore a 100° C per 10 minuti e successiva centrifugazione per eliminare eventuali precipitati. Il digerito è stato sottoposto a due cicli di filtrazione tangenziale per ottenere una frazione con taglia molecolare compatibile con quella dei peptidi bioattivi (<2.000Da). Le frazioni digerite sono state caratterizzati in RP-HPLC con isolamento dei principali picchi peptidici che sono stati confrontati con i tempi di ritenzione teorici di peptidi ad attività antitrombotica. Gli esperimenti di aggregometria sono stati condotti utilizzando un modello in vitro che prevedeva l’utilizzo di linee cellulari CHO-T562N, stabilmente trasfettate con il recettore per il fibrinogeno, e fibrinogeno ricombinante marcato con fluorocromi in modo da poter studiare il binding tra il recettore ed il fibrinogeno in presenza o meno di peptidi competitori eventualmente presenti nelle frazioni purificate.  Dall’analisi dei dati sperimentali è emerso che ci sono latti promettenti per il loro contenuto in frazioni peptidiche derivanti dalla digestione con Tripsina o Chimotripsina ad attività antiaggregante. Inoltre, questo trattamento può essere utilizzato per una produzione industriale di digeriti che possano supplementare il latte fortificato.

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